电化学发光免疫分析法测定血清胰岛素

胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种肽类激素,其血清浓度测定是评价糖尿病患者β细胞功能的常用指标。其测定方法包括放免(RIA)、酶(ELISA)、电化学发光(ECLTA)等,因各方法特异性、敏感性和试剂稳定性不同,测定结果差异大,故给临床诊治造成不便。本文用ECLIA和RIA法测定血清胰岛素、ELISA法测血清C-肽浓度,旨在探讨用ECLIA法测定血清胰岛素用于评价胰岛β细胞功能的可行性。

资料与方法:
1ECLIA的工作原理:
发光试剂三联吡啶钌[Ru(bpy)32+]和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面发生氧化还原反应。通过荧光机制衰减,发射波长为620nm的光子,这一电化学反应过程周而复始地进行,产生许多光子,使信号得以增强,检测更加灵敏。ECLIA采用磁性微珠链霉亲和素-生物素捕获系统,使抗原-抗体反应得以在磁性微珠表面快速进行,从而大大缩短反应时间(<20分钟)。反应步骤以双抗夹心法检测抗原为例:Ru(bpy)32+标记的抗体、包被好的磁珠、待测样品共同温育,形成Ru(bpy)32+-抗体-抗原-抗体-磁性微珠复合体。然后蠕动泵将反应液吸入流动室,在这里,磁性微珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面,加入TPA,电极加电压,启动ECL反应,由光电倍增管检测光强度光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线形关系,据此可测出待测抗原的含量。
2仪器与试剂:
采用德国Roche公司生产的Elecsys2010全自动电化学发光分析仪及配套试剂。RIA法试剂由中国原子能科学研究院提供,γ计数仪型号为西安262T2008P。C-肽试剂由美国BIOSOURCE公司提供,酶标仪是美国BIORAD生产的550型号。3标本来源:采自门诊和住院已被确诊的糖尿病患者,不合并肝肾等急慢性疾患,未用胰岛素治疗,口服药物治疗者停服磺脲类降糖药
3天后采血。
将血清置于-20℃冰箱贮存,待测ECLIA法和RIA法胰岛素及ELISA法测C-肽。结果:方法学评价:
（1）重复性实验:取低、中、高三个浓度的血清,每个浓度分10份检测,计算批内误差,结果ECLIA批内CV为1.97%,RIA批内CV为10.18%;用低、中、高三25个浓度血清3次独立试验测定,每次10份,计算批间误差。结果ECLIA批间CV为2.56%,RIA批间CV为13.21%。
（2）回收率:取低、中、高三组定值血清,检测3次,计算平均回收率,分别为98.6%、102%、97.7%,平均99.5%。（
3）方法学比较:用ECLIA法和RIA法分别测标本,将结果进行相关回归分析。相关系数r=0.987,假设性检验P<0.01。
（4）干扰试验:取一份定值血清,分别加入不同浓度胆红素、甘油三酯和血红蛋白标准液,以±10%以内作为无明显干扰。结果胆红素<153μmol/L、甘油三酯<20μmol/L时无明显干扰,溶血使结果明显下降。
β细胞分泌胰岛素时同时等分子产生C-肽,C-肽在血中半衰期较胰岛素长,因此常通过测C-肽浓度评价β细胞分泌胰岛素的功能。将所有标本同时测C-肽,分别与ECLIA和RIA法测定的胰岛素结果进行相关分析。ECLIA法测得胰岛素与C-肽的相关系数是0.94,RIA法测得胰岛素与C-肽的相关系数是0.91,两个相关系数的差别有统计学意义(P<0.01)。
讨论:
RIA是临床最常用测定胰岛素的方法,但由于其与胰岛素原及胰岛素类似物的交叉反应高,难以为评价胰岛β细胞功能提供准确的依据,故常同时测定C-肽浓度。ECLIA为电促发光,其结果稳定、灵敏度高、无放射性污染等问题,与其它免疫检测手段相比较具有明显的优势。ECLIA法测胰岛素与胰岛素原的交叉反应为0.05%,与糖原、生长激素无交叉反应,与胰岛素样生长因子交叉反应为0.04%,显示了良好的特异度。溶血标本对测定结果影响明显,采集标本时应避免溶血。本文显示ECLIA法测定胰岛素的各种方法学评价指标均优于RIA法(P<0.01),并且ECLIA法测定胰岛素与C-肽相关性亦优于RIA法(P<0.01),说明ECLIA法测定的胰岛素代表了体内真正起生物学作用的胰岛素浓度,即真胰岛素浓度。由于ECLIA法是目前最快捷的检测方法,因此为临床诊治糖尿病提供了更加迅速可靠的证据。