什么是RNA干扰？

 

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA，从而抑制或关闭特定基因表达的现象。只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病mRNA的表达。siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域之一，也是未来最有发展前途的新药开发领域。siRNA转染实验逐渐成为生命科学研究中常见手段。

做好siRNA转染的要点

1.纯化siRNA

siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%bing烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，因此保证实验中的每个环节不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4.选择合适的转染试剂

针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。如engreen的Entranster-R4000，专门针对siRNA等RNA转染。

siRNA转染和DNA转染有什么不同？

首先siRNA由于只有二十几个碱基对，相比DNA几千上万对碱基，小了许多。目前大多数转染试剂都针对比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子。用于转染DNA的转染试剂和方法并不完全适用于转染siRNA。

其次，siRNA转染比DNA转染对转染试剂细胞毒性的要求严格。由于转染试剂对细胞的毒性往往是对众多基因直接地或间接地上调或下调的结果，这对于过量表达的DNA转染来说，一些实验的影响不大，但对于以研究基因干扰为主要目的的RNAi实验来说，就是致命的，因为细胞死亡和RNAi实验造成的结果在现象上是一致的，轻则影响实验数据，重则改变实验结果。siRNA实验首先要求选择适合转染小的RNA的高效转染试剂，其次要求转染试剂本身的细胞毒性很小。建议选择专门针对siRNA的高效、低毒转染试剂。

siRNA转染实验常见问题？

问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？

答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。

问：哪种转染试剂效果好？

答：在选择转染试剂时，一般要考虑的是特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如Entranster系列试剂。

问：如何筛选转染试剂？

答：好的转染试剂有以下特点：1、对siRNA有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。

问：在转染时我发现有不少细胞死亡，应该如何处理？

答：转染后大多数细胞死亡表明：转染条件需要进一步地优化。在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。

问：对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？

答：对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。

问：转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？

答：转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如英格恩的纳米材料的Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡的现象可能正是由于基因干扰引起的，如果由于细胞死亡而影响检测的话，可以适当调整检测时间。实验条件的优化，包括转染前细胞密度调整，转染浓度，检测时间等。