抗体制备是免疫学研究的基础。制备一个合适的抗体将会决定着免疫实验的成败。抗体制备过程涉及到很多个方面，比如免疫原如何设计、免疫过程的优化、目的抗体筛选、抗体纯化、应用鉴定等。接下来我们将会对一些关键的技术难点进行解答。 01免疫原是如何设计的？有什么原则？

解答：免疫原可以是天然蛋白也可以是重组蛋白，甚至是多肽、DNA，所以免疫原的设计主要从两个方面考虑：免疫原分子的特点抗体应用。结合免疫原分子的特点，抗体的应用可以提供预计识别的表位类型，确定使用哪种类型的免疫原和免疫原的序列。

02DNA 免疫的原理和方法是什么？

解答：将含有编码某种抗原基因序列的质粒载体作为免疫原，直接导入动物细胞内进行表达，诱导宿主细胞对该抗原蛋白产生免疫应答，产生针对目的蛋白的抗体，再通过杂交瘤融合或基因文库筛选获得单克隆抗体，或通过血清纯化获得多克隆抗体。

03对于同一种抗原，人源的噬菌体库筛出的抗体和人体分离的抗体有什么区别？

解答：应该说各有优势。人源的噬菌体库筛选出的抗体，在一些情况下，可能会产生一些非天然存在的抗体，重链和轻链的配比不一定是天然的。从人体 B 细胞获得的抗体，是直接分离和测序筛选的，抗体的重轻链处于天然状态。当然，我们也不能说噬菌题库筛选的抗体就不好，因为一般更多的是评价它的亲和力和免疫应用，以及后续的生产表达及结构等，需要综合评价。

04噬菌体展示淘洗固相筛选和液相筛选效果有差异吗？

解答：结合义翘神州多年的抗体筛选经验，一般会选固相淘选，因为这种方法比较简单，不需要使用生物素标记。如果这种筛选方法没有筛选到我们感兴趣的抗体的话，我们也会过渡到液相筛选的方法。

05噬菌体淘洗怎么保证库的多样性？筛选上有什么注意的原则？

解答：淘洗过程中很多因素都会影响多样性的结果，比如方法的选择、固相、液相等。其次 pH 值是淘洗中一个重要参数。还有就是淘洗的力度和洗脱的时间也对多样性结果有很重要的影响。需要多个方面进行试验条件的优化。

06应用于 IHC 的单抗开发，在抗原设计上，有什么侧重点？

解答：因为 IHC 的实验过程涉及到了对它本身抗原的一个变性的过程，或者说是天然细胞里面靶点的变性过程。所以在设计的时候，我们会倾向于设计成一个线性的表位，所以一般来说我们倾向于使用多肽这种免疫原的方式，来进行免疫组化抗体的开发。

07噬菌体展示与杂交瘤制备抗体比较，哪种更好？

解答：这个可能更多是考虑噬菌体展示和杂交瘤的优缺点。首先从周期上来说的话，相对来说，噬菌体的方式时间更短一些，另外从筛选上来说的话，噬菌体展示的方法比较稳定，而且比较简单一些，操作上具有优势。但是杂交瘤的方法，毕竟是从一种类似于细胞内部产生抗体的方式，所以在某些方面的话，它产生的抗体更多的是天然的重链与轻链的配比，这一点，在噬菌体上不能做到百分之百。

08人源化抗体的制备噬菌体展示和转基因小鼠平台的优势比较？

解答：噬菌体展示技术具有周期短、准确、不受氨基酸位点限制等特点，能够通过多种淘洗和检测方式对不同表位进行筛选，生产成本相对低廉。不足之处在于受到库容、表达偏好性和展示效率的影响，抗体多样性会存在一定程度的限制，同时通过表面重塑等方法对提高人源化抗体亲和力的成功率并不稳定。

09抗体如何进行长期保存，并保持效价的稳定？

解答：一般情况下，抗体属于比较稳定的蛋白。所以多数情况下，厂家会推荐-20℃～-80℃ 长期保存即可，为了避免反复冻融尽量分装后保存。此外，也可以通过加甘油避免反复冻融。当抗体浓度低时加 BSA 减少抗体吸附起稳定剂的作用。对于一些少数抗体，需要通过优化筛选缓冲液已达到保持抗体稳定的效果，优化包括盐浓度、pH、缓冲体系等。

 

抗体制备的常见问题 01为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。

对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；

对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。

（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。

（3）免疫佐剂不合适。佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。

（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。

（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。

（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。

 

02 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？

（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。

（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。

（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份

（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。

（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。

（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。

（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO₂浓度在4-5%左右。

（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。

03 为什么融合后得不到阳性克隆？

 

答：可能的原因：

（1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。

（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。

（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。

（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。

04 为什么我的细胞生长很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。

（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。