提到ELISA，做科研的老师们都很自信

不就是简单的抗原抗体反应嘛？

但大家口中最简单的免疫反应

往往在实际操作中一个不小心

结果就会相差甚远，甚至功亏一篑

假阳性或者假阴性会让人焦头烂额

那么，这到底为什么呢？

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，再检测过程中除正常反应外，有时会出现一些错误结果，引起错误结果的原因主要有一下几个因素：

一、标本因素

二、试剂因素

三、操作因素

四、环境因素

首先我们来看看标本因素

标本因素：

标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。

内源性物质	外源性物质
类风湿因子	标本溶血
补体	标本污染
嗜异性抗体	贮存过久
自身抗体	凝集不全
医源性诱导的抗体	采血管中添加物
交叉反应物

有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物，可以不同程度影响检测结果，

1.类风湿因子

人血清中IgC、IgM型风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性，

2.补体

ELISA系统中固相一抗和二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者链接起来，从而造成假阳性。

3.嗜异性抗体

人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig（s）结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，可能造成假阳性。

4.嗜靶抗原的自身抗体

抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，再ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果，

5.医源性诱导的抗鼠Ig（s）抗体

鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能是病人体内产生抗鼠抗体，另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig（s）抗体，这些病人ELISA测定是均可产生假阳性。

6.交叉反应物质

类地搞辛、类AFP样物质等，是与靶向抗原有交叉反应的物质，再用多抗测定抗原是对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，假如交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。

外源性物质：

1.标本溶血

红细胞溶解释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，故标本采集时应避免溶血

2.标本受细菌污染

菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，同溶血标本一样，可产生非特异性显色而干扰测定结果，

3.标本保存不当

标本放置时间过长，会使抗原或抗体免疫性减弱，可出现假阴性，

4.标本凝集不全

再没有促凝集可抗凝剂的情况下，正常血液采集后1.5~2h开始凝固，18~24h完全凝固，临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，再ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性，为避免上述干扰作用，血液标本采集后最好使其充分凝固在分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

5.标本管中添加物的影响

抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣过氧化物酶活性）及分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。

试剂因素

1. 试剂应选择灵敏度高，稳定性强，批间差小，操作方便的试剂盒

2. 不同厂家的试剂不能混用，

3. 注意试剂的批号和出厂日期

   4.避免买到假的试剂盒

操作因素

一、加样

1.加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。

2.每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。

3.加酶结合物、加底物，应使加液量准确均-，加液过程迅速完成。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象。

4.有些测定需用稀释的血清,应保证稀释液与血清混合均匀。

二、洗板

在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应弓|起操作者重视。ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

三、显色

有研究报道按A、B液的顺序分别滴加和将A、B液混合后滴加，检测结果有显著差异,中值阳性和高值阳性分别平均下降了33.6%和30.0%[2]。

OPD (邻本二胺)底物显色一般在室温或37°C反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行。

TMB ( 四甲基联本胺)受光照的影响不大，可在室温中置于操作台.上，边反应观察结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

四、比色

作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。

1.定期进行保养，对滤光片要定期校正。

2.设置要正确，最好使用双波长oon

3.读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。

4.酶标仪不要安置在阳光或强光照射下，

5.使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定

环境因素

一、通风、采光与防尘

二、控制温度及湿度

三、消除噪音与电磁干扰

四、稳定水电，

 

综上所述，ELISA检测结果是受多方面因素影响，尽量避免或减少人为干扰因素对结果的影响，