二抗的定义？

第二抗体是指能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体（如IgG、IgM或IgA等）均具有反应性。

 

二抗与一抗的区别？

第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）。

 

为什么标记二抗检测以及二抗的作用？

一抗可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。二抗可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。如果一抗自己带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物，这样成本高，工作量大。所以如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗，而一抗识别底物。这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。

 

二抗的设计原理

根据同一种来源的同种亚型抗体的Fc段是保守的，根据这一原理设计出二抗，二抗与一抗的来源Fc段亚型相关。

 

如何选择正确的二抗？

1.针对一抗的宿主来源选择：二抗指向一抗的物种

2.针对一抗的类别亚型的选择： 二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。

3.二抗的种属来源：除双标实验以外，一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。

4.二抗的耦联标记：针对不同的实验方法选择不同的标记，一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物，荧光基团(FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等)、生物素、金颗粒。一般做WB、 ELISA、 IHC等实验都是推荐HRP标记的二抗，做IF FC等都是FITC标记的抗体。

5.预吸附二抗的选择：对于于富含免疫球蛋白的组织和细胞，通常推荐使用预吸附血清的二抗于蛋白质印迹应用。预吸附的二抗与内源免疫球蛋白发生相互作用的可能性较低，因此可降低非特异性背景

6.特殊要求： F(ab’)2片段形式的二抗可避免与Protein A /G或与Fc受体的结合，其分子本身比较小，更容易渗透入细胞组织结构内而灵敏度更高 。Fab片段形式的二抗是只含有一个结合位点，可用来封闭内源性的免疫球蛋白；一般无要求的都是指抗IgG H&L，它是最常用也是性价比最高的二抗形式，这类抗体和IgG分子的重链和轻链都可以反应，也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD,IgE）和亚家族反应，因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链.

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