硒缺乏雏鸡肠粘膜差异蛋白的筛选验证及信号通路研究
硒是人和动物体内重要的微量元素之一。硒缺乏导致幼龄动物腹泻,腹泻与肠粘膜免疫密切相关,而硒如何调控肠粘膜免疫尚不清楚。为了研究硒缺乏对雏鸡肠粘膜影响的分子机制,我们假设通过缺硒降低雏鸡十二指肠粘膜的抗氧化活性,增加核因子抑制剂激酶α(IKKα)的活性,并激活NF-κB通路,从而减弱免疫功能。本试验选择SPF雏鸡为试验动物,建立硒缺乏雏鸡模型,运用同位素标记相对和绝对定量-质谱联用技术(i TRAQ-LCMS/MS)定量鉴定硒缺乏雏鸡十二指肠粘膜差异蛋白质组。并使用生物信息学方法进行通路富集分析寻找差异代谢通路。采用Western Blot法验证十二指肠粘膜差异蛋白DNA拓扑异构酶β(TOPIIIβ)、蛋白酪氨酸激酶(PTK)、丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT2),并分析NF-κB信号通路相关蛋白,P50,IKKα和双特异性促分裂原活化蛋白激酶(MEK2)。通过实时定量PCR(RT-Q-PCR)检测十二指肠粘膜差异蛋白TOPIIIβ、AKT2、PTK等m RNA的表达量。采用ELISA酶联免疫吸附法测定各段肠粘膜的分泌型免疫球蛋白A(SIg A)、十二指肠粘膜的氧化型谷胱甘肽(GSSG),谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性,并检测十二指肠粘膜的P65、NF-κB p65 DNA结合、p-IκB和IκB及炎性因子的活性。试验结果表明:1.与对照组相比,硒缺乏组血液及十二指肠粘膜组织中硒含量第7 d、21 d和35 d均降低,其中第7 d显著降低(p<0.05),第21 d和35 d极显著降低(p<0.01)。综合硒缺乏组雏鸡临床症状(精神萎靡,体重减轻和腹泻)和病理学检查(肌肉苍白,十二指肠出血和渗出性素质病)表明硒缺乏雏鸡模型成功建立。2.运用i TRAQ技术,识别和定量分析软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4,按score>1.2,或<0.83(p<0.05)Mascot筛选,最终发现硒缺乏雏鸡在7 d、21 d、35 d三个时间点,分别鉴定67种、127种、119种已知差异蛋白。在3个时间点共有25个差异蛋白具有表达一致性,其中有13个上调一致性蛋白,12个下调一致性蛋白。这25个差异蛋白KEGG通路分析富集在“Ras信号转导”等18个通路(p<0.05)。3.在试验期第7 d、21 d、35 d,Western Blot结果显示,硒缺乏组雏鸡十二指肠粘膜TOPIIIβ蛋白在三个时间点的表达量分别是对照组的0.37倍、0.36倍、0.34倍;硒缺乏组AKT2蛋白分别是对照组的0.76倍、0.33倍、0.55倍;硒缺乏组PTK的表达量分别是对照组的1.12倍、0.89倍、2.16倍,验证结果与i TRAQ鉴定差异蛋白结果一致。硒缺乏组IKKα蛋白在三个时间点的表达量分别是对照组的2.16倍、2.10倍、2.31倍;在第7 d与21 d硒缺乏组MEK2的表达量分别是对照组的0.83倍与0.86倍,而在35 d硒缺乏组MEK2表达量是对照组的1.60倍;NF-κB(p50)表达在硒缺乏组显著增加(p<0.05);这些参与NF-κB信号通路的硒缺乏差异蛋白被证实与i TRAQ鉴定结果一致。4.RT-Q-PCR结果显示,在7 d、21 d和35 d,硒缺乏组雏鸡十二指肠粘膜组织PTK表达高于对照组;硒缺乏组TOPIIIβ、AKT2、GPx1 m RNA表达水平低于对照组;MEK2 m RNA表达量在35d硒缺乏组增加(p<0.05),这些基因表达水平与蛋白质组分析结果一致。5.ELISA结果显示,在7 d、21 d和35 d,硒缺乏引起雏鸡十二指肠粘膜SIg A分泌量显著降低(p<0.05);在21 d和35 d,硒缺乏引起雏鸡空肠、回肠、盲肠和直肠粘膜中SIg A分泌量显著降低(p<0.05)。并且硒缺乏导致雏鸡十二指肠粘膜GSSG活性升高,GSH和GPx活性减少(p<0.05)。硒缺乏导致雏鸡十二指肠粘膜p-IκB、p65和NF-κB p65 DNA结合活性增高,IκB表达量降低(p<0.01)。此外,硒缺乏增加雏鸡十二指肠粘膜促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、干扰素γ和白介素-17A的表达量,抑制抗炎细胞因子转化生长因子(TGF-β1)和白介素-10的表达量。这说明硒缺乏通过激活雏鸡十二指肠粘膜NF-κB信号通路,降低免疫功能。综上所述,本试验在硒缺乏蛋白质组学研究基础上,证明了硒缺乏降低雏鸡十二指肠粘膜抗氧化活性及SIg A的分泌量,增加了IKKα和p50蛋白的表达量,并激活NF-κB信号通路,从而降低十二指肠粘膜免疫功能,促进炎症的发生。