免疫组化染色基本技术及注意事项

1.ELISA试剂盒实验计划
① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。
③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)
(1)工作液:无须稀释
(2)原液:
① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如:工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验;
若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。
② 原液的保存(-20℃)冻存--应选稀度冻存。
③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于 冰箱备用。
④ 关于Ab保存应参照说明书。
(3)Ab浓度的选择
Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。--并非Ab浓度越高越好。
3.Ab滴片技术
-- ELISA试剂盒所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要领:甩净组织周围的水。
4.PBS洗涤技术
(1)洗涤的目的
① 保证离子浓度和PH值。
② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)
(2)方法:洗三次，每次5分钟。
5.Ab孵育技术
(1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
(2)温度与时间 4℃:过夜;
37℃:2 h or 参考说明书
6.进
1.ELISA试剂盒实验计划
① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。
③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)
(1)工作液:无须稀释
(2)原液:
① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如:工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验;
若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。
② 原液的保存(-20℃)冻存--应选稀度冻存。
③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于 冰箱备用。
④ 关于Ab保存应参照说明书。
(3)Ab浓度的选择
Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。--并非Ab浓度越高越好。
3.Ab滴片技术
-- ELISA试剂盒所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要领:甩净组织周围的水。
4.PBS洗涤技术
(1)洗涤的目的
① 保证离子浓度和PH值。
② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)
(2)方法:洗三次，每次5分钟。
5.Ab孵育技术
(1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
(2)温度与时间 4℃:过夜;
37℃:2 h or 参考说明书
6.ELISA试剂盒光镜控制显色方法
(1)室内操作:注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。
(2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。
光镜控制显色方法
(1)室内操作:注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。
(2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。