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高效液相色谱法仪器结构与原理

发布时间:2018-12-21 10:52 |  点击次数:

高效液相色谱法仪器结构与原理

高效液相色谱仪现在多做成单元组件,然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来,最基本的组件是输液泵、进样器、色谱柱、检测器和工作站(数据系统)。此外,还可根据需要配置自动进样系统、流动相在线脱气装置和自动控制系统等。图10.1是普通配置的高效液相色谱仪的原理图。输液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系,在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分被分离,并依次随流动相流至检测器,检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。

 

1、高压(输液)泵

高压泵的作用是将流动相以稳定的流速(或压力)输送到色谱系统。其稳定性直接关系到分析结果的重现性、精度和准确性。因此其流量变化通常要求小于0.5%。流动相流过色谱柱时会产生很大压力,高压泵通常要求能耐40~60MPa的高压。

2、进样器

现代的液相色谱仪几乎都采用耐高压、重复性好和操作方便的阀进样器。最常用的是六通阀进样器,进样体积由定量管确定,通常使用的是10,20和50μL体积的定量管。进样器的结构如图10.2所示。操作时先将阀柄置于采样位置(10ad),这时进样口只与定量管接通,处于常压状态,用微量注射器(体积应大于定量管体积)注入样品溶液,样品停留在定量管中。将进样器阀柄转动60。至进样位置(inject)时,流动相与定量管接通,样品被流动相带到色谱柱中。

 

3、色谱柱

色谱柱是实现分离的核心部件,要求柱效高、柱容量大和性能稳定。最常用的分析型色谱柱是内径4.6mm,长100~300mm的内部抛光的不锈钢管柱,内部填充5~10μm粒径的球形颗粒填料。不同的物质在色谱柱中的保留时间不同,依次流出色谱柱进入检测器。

4、检测器

检测器是用来连续检测经色谱柱分离后流出物的组成和含量变化的装置。它利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理,当被测物从色谱柱流出时,检测器把化学信号转化为可测量的电信号,以色谱峰的形式表现出来。几种主要检测器的基本特性列于表10.1。

 

5、紫外-可见光(UV-VIS)吸收检测器

UV-VIS吸收检测器既有较高的灵敏度和选择性,也有很宽广的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感,所以适用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时,为了得到高的灵敏度,常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长,但为了选择性或其他目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长,另外,应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。

二极管阵列UV-VIS检测器可以瞬间实现紫外-可见光区的全波长扫描,同时得到时间一波长-吸收强度三维色谱图。它可与色谱工作站联用获得样品纯度的信息。

6、示差折光检测器

示差折光检测器也称折射指数检测器(RI),是一种通用型检测器。凡是与流动相的折射率有差别的被测物都可以采用RI检测。在多数情况下,被测物与流动相的折射率都有差异,所以RI检测器应用范围很广,特别是在凝胶色谱中应用较多。但与其他检测方法相比,灵敏度要低1~3个数量级。因为折射率对温度的变化非常敏感,因此难于用于梯度洗脱。

7、荧光、化学发光检测器

许多有机化合物,特别是芳香族化合物、生化物质,如有机胺、维生素、激素、酶等,被一定强度和波长的紫外光照射后,发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光,但可以与发荧光物质反应,衍生化后检测。荧光检测的最大优点是有非常高的灵敏度和良好的选择性,灵敏度要比紫外检测器高2~3个数量级,而且所需样品量很小,特别适合于药物和生物化学样品的分析。

化学发光的原理是基于某些物质在常温下进行化学反应,生成处于激发态的反应中间体或反应产物,当它们从激发态返回基态时发射出光子,因为物质激发态的能量来自于化学反应,故称化学发光。化学发光检测器结构简单、价格便宜,而且灵敏度和选择性都很高,是一种有实用价值的检测方法。

8、电化学检测器

电化学检测器是利用物质的电活性,通过电极上的氧化或还原反应进行检测。电化学检测有很多种,如电导、安培、库仑、极谱、电位等,应用较多的是安培检测器。电化学检测器对流动相的限制较严格,电极污染常造成重现性差等缺点,所以一般只用于检测那些既没有紫外吸收又不产生荧光但有电活性的物质。

9、工作站

工作站可在线模拟显示所有分析过程,自动采集数据、处理和储存,并能实现分析过程中仪器的自动控制。如果设置好有关分析条件和参数,可以自动给出最终分析报告。