关于如何使用我们配对的抗体对试剂盒进行夹心ELISA的详细协议。
匹配的抗体对试剂盒包括捕获和生物素化检测器抗体对和校准蛋白质标准。试剂盒有两种规格，有2种或10种X 96孔板的足够的试剂。
化验需要额外的缓冲和盘子。配件包可以购买包含所有所需试剂进行10×96孔板sandwich ELISA。
协议概述
1 将捕获抗体稀释到涂层缓冲液中。
2 孵化后洗。
3 过阻断缓冲液孵育，然后阻断非特异蛋白质相互作用。
4 将标准、控制和样品添加到板上，一式两份。
5 培养板，然后洗。
6 添加检测抗体。孵化后洗。
7 添加辣根过氧化物酶链霉亲和素溶液进行检测。孵化后洗。
8 通过加入TMB底物检测。
9 添加停止液。
10 测量板在450 nm的端点和/或600纳米动力学的微孔板读写器。
详细的协议
1 添加50µL 2µ克/毫升每井96井高结合微孔板捕获抗体（我们建议西面™给MaxiSorp™96孔板）。
2 用板封封板。培养板无论是在4°C或在盘子上的摇杆或摇床室温2小时。
3 洗板三次，350µL的推荐1x Wash Buffer。用力将盘子用力拍打在吸水毛巾上，从最后一次清洗中完全除去液体。
4 减少非特异性结合加入300μL 1X缓冲每个好，封板和孵化一夜之间在4°C或室温2小时。
5 重复步骤2中的清洗过程。
6 板可阻断或免疫1x缓冲稳定立即用和储存在4°C.
7 在使用前立即准备连续稀释的标准。准备足够的标准溶液以重复测量每个浓度。
8 重组蛋白标准样品加入100µL水水。在室温下轻轻搅拌10分钟，以确保蛋白质完全溶解。这是股票标准解决方案。未使9 用的重组蛋白标准应分装和存储80°C.
注：请参阅小瓶标签以查看所提供的蛋白质标准数量。
10 标签八管，标准# 1–8。
11 准备标准# 1，稀在1x封闭液的浓度最高，在产品数据表中指定的库存标准。一个七点的标准在1x缓冲建议采用2倍连续稀释曲线。
12 标准# 8空白对照（缓冲区只）和不含标准蛋白
13 1x封闭缓冲液稀释实验样品。稀释样品使结果的浓度在测定的动态范围之内。使用多个样品稀释1:2稀释系列是如果目标蛋白的浓度是未知的建议。
14 每口加50克稀释标准和样品。密封板孵育在板台集400 rpm室温2小时。
15 洗板三次，350μL 1X Wash Buffer（ab206977）。用力将盘子用力拍打在吸水毛巾上，从最后一次清洗中完全除去液体。
16 稀释检测抗体从0.25毫克/毫升的股票集中到建议的工作协调0.5μg/mL 1x封闭液或其他适当的稀释剂。请参阅标签以查看所提供的检测抗体数量。
注意：为了达到最佳效果，工作溶液中的抗体浓度可能需要优化。
17 每口加50稀释抗体。密封板孵育1小时在一个板台集400 rpm室温。
18 重复清洗步骤，如步骤14所述。
19 添加50μL HRP Streptavidin溶液稀释（稀释）1x封闭液在每。密封板孵育1小时在一个板台集400 rpm室温。
20 重复清洗步骤，如步骤14所述。
21 加入TMB底物100μl每个以及培养板上的振动筛设置到400转在黑暗中长达20分钟。
注意：为了获得最佳效果，孵化时间需要优化。
22 每井加100微米停止液。将摇板放在摇板上搅拌1分钟。板在400 nm处可以读取动力学，以监测适当的孵育时间。​
23 有关更多信息，请参见ELISA故障排除技巧。
24 测量板在450 nm处。
25 分析如下所述的数据。
分析数据
计算空白控制（零）标准的平均吸光度值。减去所有其他吸光度值的平均空白对照标准吸光度值。
创建一个标准曲线的绘制平均每个标准浓度减去空白对照的吸光度值（Y‑轴）对目标蛋白的浓度（X轴）的标准。利用绘图软件通过这些点绘制最佳光滑曲线，建立标准曲线。注意：大多数微孔板阅读器软件或绘图软件将绘制这些值并将曲线拟合到数据。四参数曲线拟合（4PL）通常是最好的选择；但是，其他算法（如线性，半日志，日志/日志，应用Logistic）也可以进行测试以确定它是否提供了一个更好的拟合曲线的标准值。
看到我们在计算ELISA原数据的更多信息研讨会。
查看我们的ELISA优化指南，设计自己的夹心ELISA。
推荐试剂和消耗品
匹配的配对抗体试剂盒的配件包（10×96孔板）：含西面™给MaxiSorp™96孔板，板密封，Coating Buffer，10x Wash Buffer，10x缓冲，TMB和终止液
现在™给MaxiSorp™96孔板
涂层的缓冲1x35毫米15毫米的NaHCO3、Na2CO3、NaOH溶液pH值9.6
缓冲10x
​稀释在PBS为1X：1%牛*，0.05%吐温®1x PBS，pH 20，7.4
我们建议≥纯度96%的BSA BSA可以增加背景不单纯
洗涤缓冲10x
稀水为1X：0.05%吐温®20 1x PBS
TMB底物
终止液：4.9%磷酸
Saline 10x磷酸盐缓冲液（PBS）
稀释在水中移动：0.14 M NaCl，0.003 M KCl，0.002米0.01米，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠
亲和素溶液，50μ克/毫升
推荐稀释0.01-0.05μg/mL 1x缓冲
稀释标准离心管
双蒸馏水（双蒸水）
可选：蛋白酶抑制剂
可选：BCA蛋白定量试剂盒