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流式检测结果优化——抗体滴定

发布时间:2018-12-21 11:06 |  点击次数:

抗体滴定(antibody titration)就是确定最佳的抗体用量和抗体浓度,以实现阳性信号尽可能强,而阴性信号尽可能低即得到最优的S/N(信噪比值)。一般抗体供应商都会推荐抗体使用量, 如Test包装抗体。但为了达到最好实验效果及节省抗体,我们则需要自己做滴定,尤其在多指标流式检测实验中,抗体滴定就更加重要了

 

 

根据S/N值,可以得出0.1ug为最优用量

 

具体的抗体滴定步骤如下:

 

以APC-CD49b(BioLegend  Cat#108909)抗体为例,浓度为0.2mg/ml,推荐抗体使用浓度为 ≤0.25 μg/100ul 。起始滴定浓度一般为推荐浓度的两倍(即起始浓度为0.5ug/100ul),做8次2倍稀释。假设用100ul体积,在第一孔/管的97.5ul稀释液里加入2.5ul抗体,然后从第一孔/管取出50ul加入第二孔/管的50ul稀释液中,从第二孔/管中取出50ul加入至第三孔/管的50ul稀释液,依次倍比稀释,最后,向每个孔中加入50ul细胞,注意整个操作,抗体要充分混匀。

 

此外,您还需了解两个概念:抗体饱和浓度和最佳分离浓度,前者是指能够发出最大荧光强度的最低抗体浓度,后者是指能够使您的结果S/N值最优的抗体浓度。对于某些抗体而言,最佳分离浓度可能远低于饱和浓度。但正是因为最佳分离浓度小于饱和浓度,所以染色后的荧光强度是与时间、温度等等条件都相关的。一般建议在使用某种抗体前,都要进行滴定。滴定结果依赖于样本、染色步骤、流式仪器型号、滤光片配置等等条件。例如:在用固定/破膜法和表面标记法两种情况下,滴定结果是不同的;而在滴定人类细胞和猴细胞样本,结果也是不同的。

 

抗体滴定并不是以抗体量/细胞数来表示的,滴定的是抗体浓度(如ug/ml),其与细胞量在标记10万和1000万个细胞范围内相关性不大。如果您准备用于标记1亿个细胞,千万不要将抗体用量也增加100倍。通常只需增加2-5倍即可,有时甚至不用增加用量。如果您经常标记1亿个细胞(如分选细胞时),做2-3个点的快速滴定是很有用的。同样的道理,如果您只标记5万个细胞,那么也千万不要减少抗体用量。记住,与抗体用量相关的指标是浓度(抗体量/染色体积)。这意味着,如果您是100ul的体积下进行滴定抗体,而染色时使用1ml的体积,那么你就需要用10倍的抗体量。同样的道理,如果您在200ul体积下进行滴定,而染色时使用50ul体积,那么您就需要用1/4的抗体量。

 

染色之后,一般确定SI(染色指数)或S/N(信噪比)最高的浓度,但有时也需要考虑一下抗体用量。